O Laboratório

 

 

Gentox – Laboratório de Genética Toxicológica

 

Manual de Procedimentos

 A.Cultivo Celular
Meios de Cultivo 2
Soluções de uso geral 4
Procedimentos de cultivo celular 6
Limpeza e esterilização 9
B. Ensaios
Ensaio de Citotoxicidade – Resazurina 1
Ensaio de Citotoxicidade – MTT 2
Ensaio do Micronúcleo 3
Ensaio do Cometa 9
Aberrações cromossômicas in vitro 18
Cultura de linfócitos para cariótipo humano 22
RT-PCR em tempo real 26
C. Procedimentos de rotina
Procedimentos para uso do medidor de pH 1
Procedimentos para uso da balança analítica 2

 

 

A. Cultivo celular

 

As células de mamíferos utilizadas na avaliação de mutagenicidade e antimutagenicidade devem ser capazes de crescimento e divisão rápida em cultura. Dentre as células mais utilizadas na mutagênese é possível citar: V79 (fibroblasto de pulmão de Hamster chinês), CHO-K1 e CHO-9 (células de ovário de Hamster chinês), Hep-2 (células de carcinoma de laringe humano) e linfócitos T, entre outras. Dentre as células citadas apenas os linfócitos são cultivados em suspensão, as demais células são cultivadas na forma de monocamada, pois são células de aderência, isto é, são capazes de fixar-se ao frasco de cultura através da produção de uma matriz glicoproteica extracelular. O cultivo é realizado em estufa à 37ºC, sob condições assépticas.

 

 

Linhagem MCF-7 em cultura (20x)

1. Meios de cultivo

 

In vitro, o meio de cultura deverá conter os nutrientes necessários para crescimento ou seleção celular. Dentre os meios de cultivo é possível citar: D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Médium) e Ham F-10, sendo ambos indicados para células de aderência, além do RPMI 1640 indicado para células em suspensão.

 

Nome Fabricante N° do Catálogo Especificação
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GibcoBRL 12100-046 Pó; alta concentração de glicose; sem L-Glutamina; sem hipocloreto de piridoxina; sem piruvato de sódio; sem bicarbonato de sódio
F-10 Nutrient Mixture (Ham) GibcoBRL 81200-040 pó; com L-Glutamina; sem bicarbonato de sódio
RPMI 1640 GibcoBRL 31800-022 pó; com L-Glutamina; sem bicarbonato de sódio

 

1.1. Preparo de meios de cultivo

 

DMEM F-12 com Hepes

Meio de cultivo 1 pacote
Bicarbonato de sódio NaHCO3 (PM 84,01) 1,2 g
Solução Antibiótico-antimicótica GibcoBRL cat.:15240-096 1 mL
Água destilada q.s.p. 1000 mL

 

DMEM F-12 sem Hepes

Meio de cultivo 1 pacote
Bicarbonato de sódio NaHCO3 (PM 84,01) 2,438 g
Solução Antibiótico-antimicótica GibcoBRL cat.:15240-096 1 ml
Água destilada q.s.p. 1000 mL

 

 

DMEM

Meio de cultivo 1 pacote
Bicarbonato de sódio NaHCO3 (PM 84,01) 3,7 g
Solução Antibiótico-antimicótica GibcoBRL cat.:15240-096 1 ml
Água destilada q.s.p. 1000 mL

 

Modo de preparo:

Dissolver em balão volumétrico de 1000ml o meio de cultivo com cerca de 500ml de água destilada. Acrescentar o bicarbonato de sódio e solução antibiótico-antimicótica, agitar e completar o volume com água destilada. Agitar por cerca de 15 minutos protegido da luz direta. Corrigir o pH para 7,2 e filtrar em membrana de 0,22μm. O meio deve ser  guardado em frascos esterilizados e identificados com o nome do meio, a data de produção e o responsável. Caso o frasco seja encaminhado para congelamento reforçar a tampa com fita adesiva. Cobrir a tampa com papel alumínio flambado.

 

1.2. Meio de cultivo: Solução Uso

 

Em células de mamíferos uma série agentes mitogênicos são capazes de conduzir a célula através do ciclo celular, permitindo que a mesma entre em mitose. Em cultura de linfócitos é necessária a adição de fito-hemaglutinina, um agente mitogênico específico para este tipo celular.

Como os meios de cultivo não contêm substâncias mitogênicas, faz-se necessário a adição de estimulantes de divisão, tais como  o fator de crescimento presente no soro bovino fetal (SBF), por este motivo antes de iniciar o uso na cultura este é adicionado numa proporção que varia entre  5 a 20%, dependendo das necessidade de cada tipo celular (Exemplo em células V79 utiliza-se a adição de 10% de SBF).

 

2. Soluções de uso geral

 

2.1. PBS LIVRE DE Ca2+ e Mg2+

 

KCl (PM 74,55) cloreto de potássio  0,2 g
KH2PO4 (PM 136,09) fosfato monobásico de potássio  0,2 g
NaCl (PM 58,44) cloreto de sódio 8,0 g
Na2HPO4 (PM 141,96) fosfato dibásico de sódio anidro 1,15 g
H2O deionizada q.s.p. 1000 ml

 

 

Modo de preparo e observações:

Em balão volumétrico dissolver todos os sais em água deionizada, agitar até completa solubilização. Corrigir o pH para 7,4. Para uso em cultura aliquotar em frasco com a tampa frouxa coberta com papel alumínio e vedada com papel manilha e barbante, encaminhar para autoclavagem 120ºC por 30 minutos. Aliquotar em frascos de 100ml identificando-os com a solução, o dia de preparo e o responsável, cobrindo a tampa do frasco com papel alumínio flambado.

 

2.2. Solução balanceada Salina de Hanks sem Ca2+ e Mg2+

KCl (PM 74,55) cloreto de potássio 0,4 g
KH2PO4 (PM 136,09) fosfato monobásico de potássio 0,06 g
NaCl (PM 58,44) cloreto de sódio 8,0 g
NaHCO3 (PM 84,01) bicarbonato de sódio 0,35 g
Na2HPO4.7H2O (PM 288,07) fosfato dibásico de sódio 0,09 g
D-Glucose anidra C6H12O6 (PM 180,16) 1 g
Fenol Vermelho 0,01 g
H2O deionizada q.s.p. 1000 mL

 

 

 

 

 

Modo de preparo:

Em balão volumétrico adicionar todos os sais e completar o volume com água deionizada, agitar até completa diluição. Corrigir para pH 7,4.

 

2.3. Tripsina EDTA

A tripsina é uma enzima proteolítica, utilizada no cultivo de células de aderência para o desprendimento das células do frasco, através degradação da matriz glicoproteica extracelular.

 

2.3.1. 0,25%

EDTA-titriplex C10H14N2Na2O6.2H2O (PM 372,24) 1 g
Tripsina (1:250) GibcoBRL cat.: 27250-042 2,5 g
PBS 1000 mL

 

2.3.2. 0,1%

EDTA-titriplex C10H14N2Na2O6.2H2O (PM 372,24) 0,4 g
Tripsina (1:250) GibcoBRL cat.: 27250-042 1 g
PBS 1000 mL

 

Agitar até completa diluição. Filtrar em membrana 0,22 μm e aliquotar em frascos pequenos identificados. A tripsina é inativada por aquecimento.

 

3. Procedimentos de cultivo celular

 

3.1. Esterilização da câmara asséptica

 

Ligar as lâmpadas de UV por pelo menos 15 minutos antes do uso da câmara para esterilização de superfícies.

 

3.2.  Descongelamento de células

 

Material necessário: vidro de descarte, pipeta pasteur, pipetas de 10ml,  meio de cultura com soro bovino em 37ºC, grade, tubo de cultura.

 

Procedimento:

 

- Remover as células do nitrogênio líquido;

- Descongelar rapidamente;

- Transferir para o frasco de cultura com 10 ml de meio de cultivo;

- Identificar o frasco como descongelamento, tipo celular, data e responsável pela cultura.

- Encaminhar para estufa 37ºC.

- Após 4-6h, trocar o meio de cultura.

 

3.3. Repique e Manutenção das células

 

Material necessário: pipetas de 1ml, 5ml  e 10ml, meio com soro em 37ºC, tripsina 0,025%, PBS em temperatura ambiente, vidro para descarte, pinça e frascos de cultura.

 

Procedimento:

- Descartar o meio de cultivo;

- Lavar as células duas vezes com 5ml de PBS, adicionando o PBS pelo teto do frasco;

- Remover o excesso de PBS com pipeta Pasteur;

- Adicionar 0,5ml de tripsina;

- Fechar e deitar o frasco, certificando-se que a tripsina entre em contato com toda a superfície celular;

- Aguardar o desprendimento das células;

- Inativar a tripsina com 1,5ml de meio de cultivo;

- Homogeneizar;

- Transferir gotas de suspensão celular (ver Tabela 1) para um novo frasco de cultivo contendo: 10ml de meio para frascos de manutenção ou 5ml de meio para pré-frascos e/ou experimentos.

- Fechar o frasco e identificar com tipo celular, procedimento (manutenção com o número da passagem, ou pré-frasco), data, e responsável pela cultura;

- Encaminhar as células para estufa de 37ºC.

 

3.4. Congelamento

 

Materiais necessários: 1 ampola de congelamento (para cada frasco de células a ser congelado), ponteiras azuis, meio de cultivo com soro a 37ºC, soro bovino fetal, dimetilsulfóxido (DMSO), tripsina 0,1%, PBS.

 

Procedimento:

- Descartar o meio de cultivo;

- Lavar as células duas vezes com 5 mL de PBS, adicionando o PBS pelo teto do frasco;

- Remover o excesso de PBS com pipeta Pasteur;

- Adicionar 0,5 mL de tripsina;

- Fechar e deitar o frasco, certificando-se que a tripsina entre em contato com toda a superfície celular;

- Aguarde o desprendimento das células;

- Inativar a tripsina com 0,8 mL de soro bovino fetal;

- Adicionar 0,5 mL de meio de cultivo com soro;

- Adicionar lentamente 0,2 mL de DMSO;

- Homogeneizar e transferir todo o conteúdo para uma ampola de congelamento;

- Identificar a ampola com o tipo celular, data de congelamento e responsável;

- Encaminhar a ampola para o freezer -80ºC overnight;

- Acondicionar as ampolas no balão de nitrogênio líquido;

- Anotar no livro de controle de células a quantidade de ampolas, a data e a canaleta em que foram colocadas.

 

4. Limpeza e esterilização

 

4.1. Álcool 70°

 

Em uma proveta de 1000ml adicionar cerca de 600ml de álcool etílico absoluto. Mergulhar o Alcoômetro. Adicionar a água destilada até o menisco do alcoômetro indicar 70º.  Acondicionar em frasco âmbar, identificando-o.  O álcool 70º deverá ser colocado no borrifador para a sala asséptica, assim como deve ser utilizado para os algodões de assepsia.

 

4.2. Formol (Lysoform)

 

Utilizar a solução comercial. Aplicar formol sobre a bancada do fluxo laminar uma vez por semana. Uma vez por mês aplicar formol na grade do fluxo e ligá-lo para a limpeza do sistema de ventilação.

 

4.3. Extran Neutro

Para um frasco reutilizado de Álcool comercial de 1000ml, colocar o volume equivalente a um dedo de Extran Neutro concentrado, e adicionar água de torneira até completar o volume.

 

4.4. Sulfocrômica

- Dilua 30 g de dicromato de potássio em pó em 500 mL de água destilada;

- Aqueça levemente até dissolver;

- Retire do fogo e deixe esfriar;

- Acrescente lentamente 450 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) tendo o cuidado de colocar o balão dentro de uma bacia com gelo, enquanto se adiciona o H2SO4, para esfriar. CUIDADO, o balão pode explodir;

 

ATENÇÃO:

  1. A Solução é altamente corrosiva;
  2. Deve ser mantida em recipiente seguro e tampado;
  3. No seu manejo é necessário o uso de avental, máscara e luvas;
  4. Em caso de contato com a pele, lave rapidamente a região atingida com água ou solução de bicarbonato;
  5. Quando a solução estiver velha, coloque-a em frascos identificados para posterior descarte.

 

4.5. Procedimentos para limpeza de material

 

- Todo material utilizado deve ser colocado em balde com extran neutro, no qual permanecerá overnight;

- os materiais plásticos devem ser limpos com buchas e a vidraria deve ser limpa com buchas e escova;

- o material deve ser enxaguado várias vezes com água corrente de torneira;

- encaminhar o material para um balde contendo água destilada, mergulhar o material certificando-se que não haja bolhas de ar, o material deverá ficar em água destilada overnight;

- substituir a água destilada, e retornar o material, deixando-o novamente overnight;

- remover o material da água e levar para a estufa de madeira (37ºC);

- após completada a secagem, encaminhar o material para embalagem, ou armazenamento;

 

ROLHAS DE SILICONE

 

Tampas de silicone deverão ter resíduos de fita adesiva removidos com xilol, antes de serem colocadas no extran. Também deverão ser fervidas por 30 minutos antes de serem autoclavadas.

 

PIPETAS PASTEUR E GRADUADAS.

 

Após o uso remover o algodão e encaminhar as pipetas para solução sulfocrômica por no mínimo 4 horas. As pipetas devem ser colocadas no tubo de sulfocrômica com a extremidade mais fina pra cima. Enxaguar em água corrente no lavador de pipetas por cerca de 4 horas. Encaminhar as pipetas para secagem em estufa.

 

FILTRO À VÁCUO

 

- Após o uso, encaminhar o filtro para a lavagem;

- abrir o filtro, remover a membrana de filtração 0,22μm;

- lavar o filtro com bucha e extran neutro;

- enxaguar bem em água corrente;

- enxaguar em água destilada;

- secar na estufa de 37ºC e guardar.

 

4.6. Acondicionamento de materiais para autoclavar.

 

PIPETAS E PIPETAS PASTEUR

 

- tampar a extremidade superior da pipeta com algodão;

- queimar os fios de algodão excedentes;

- enrolar a pipeta com tiras de papel alumínio, certificando-se que o papel fique firme e cubra toda a superfície da pipeta;

- empacotar as pipetas com papel manilha, identificando o volume das mesmas;

- encaminhar para autoclavagem.

 

VIDROS PARA SOLUÇÕES E DESCARTE

 

- Tampar primeiramente a boca do frasco com papel alumínio;

- cobrir todo o frasco com papel alumínio;

- cobrir o frasco com papel manilha;

- encaminhar para a autoclavagem.

 

VIDROS COM TAMPA

 

- Conferir a quantidade de rolhas de silicone, etc.

- afrouxar a tampa do frasco;

- cobrir a tampa com papel alumínio;

- cobrir com papel manilha, amarrando com barbante;

- encaminhar para autoclavagem.

 

CAIXAS DE PONTEIRAS

 

- aferir a quantidade de ponteiras;

- cobrir com papel alumínio;

- recobrir com papel manilha;

- encaminhar para autoclavagem.

 

FILTROS PARA ESTERILIZAÇÃO À VÁCUO

 

- Abrir o filtro;

- encaixar a parte inferior do filtro no bocal de um  Kitassato;

- colocar uma ou duas membranas de filtro 0,22μm sobre a base do filtro;

- fechar o filtro tomando cuidado para que a membrana não se desloque ou dobre;

- colocar a mangueira de silicone com algodões, na saída do Kitassato;

- cobrir a extremidade da mangueira com papel alumínio;

- cobrir o filtro com papel alumínio;

- embalar o Kitassato com o filtro em papel manilha;

- encaminhar para autoclavagem.

 

4.7. Uso da autoclave

 

- Com o auxílio do pedal (A, ver figura 1), abrir a tampa da autoclave;

- Remover o cesto de metal e verificar o nível de água, que deverá estar próximo aos – retentores do cesto, corrigir o nível de água caso necessário;

- Devolver o cesto ao interior da autoclave;

- Abaixar a chave elétrica na parede;

- Colocar o indicador (E) na posição 1;

- Dispor os materiais a serem autoclavados no cesto, os mesmos deverão estar devidamente embalados e identificados;

- Com o auxílio do pedal (A) fechar a tampa da autoclave;

- Colocar a mangueira de vapor para o exterior da sala;

- Verificar a válvula (C), deixando-a aberta;

- Fechar as travas (D). As travas dispostas à 180º umas das outras, devem ser fechadas ao mesmo tempo para distribuição da força de vedação;

- Aguardar até uma saída intensa de vapor pela mangueira;

- Fechar a válvula (C);

- Aguardar a temperatura chegar a 120ºC (B);

- Colocar o indicador (E) na posição 2;

- Aguardar 20 minutos para o processo de esterilização;

- Transcorrido o tempo, girar o indicador (E) para a posição zero, e desligar a chave de energia;

- Aguardar o resfriamento da autoclave, abrir a válvula (C) e posteriormente a autoclave;

- Encaminhar o material para secagem na estufa;

 

Figura 1 – Representação da autoclave

A. Ensaios

 

1. Ensaio de Citotoxicidade – RESAZURINA

 

- Utilizar placa de cultivo celular com 24 poços.

- Para o experimento semear 5×104 células (no caso da HepG2) em cada poço em 500uL de meio de cultura com soro (Obs. Deixar poços sem células – branco).

- Esperar um período de 24 horas para estabilização.

- Após o período de estabilização retirar o meio de cultura e adicionar os tratamentos incluindo o controle o agente citotóxico do experimento.

- Após o período retirar o tratamento e lavar com PSB 2 vezes.

- Adicionar meio de cultura com a resazurina na concentração final de 60μM em cada poço e incubadas por 3 horas na estufa de CO2.

- Retirar a placa da estufa em fazer a leitura em microplacas VICTOR 3 (530-560 nm de excitação e 580-600 nm de emissão).

 

Imagem da placa com resazurina

2. Ensaio de Citotoxicidade –MTT

 

- Utilizar placa de cultivo celular com 96 poços;

- Para o experimento, delinear a quantidade de células a ser utilizada em cada poço em 100 uL de meio de cultura suplementado com SBF (Obs. Deixar poços sem células – branco);

- Esperar um período de 24 horas para estabilização;

- Adicionar 100 uL dos tratamentos incluindo o controle citotóxico (controle positivo) do experimento;

- Depois do período de tratamento (24, 48, 72 horas), retirar os tratamentos e adicionar o MTT em uma concentração final de 0,5 mg/mL dissolvido em meio de cultura sem SBF;

- Aguardar 4 horas, retirar todo o meio e adicionar 100 microlitros de DMSO;

- Homogeneizar e fazer a leitura da placa em espectrofotômetro a 540 nm.

 

Exemplo de um experimento em placa de 96 poços, sendo 3 tratamentos e 5 concentrações distribuídos em 4 replicatas.

 

3. Ensaio do micronúcleo em V79 binucleadas in vitro

 

O teste do micronúcleo tem sido utilizado nos estudos de compostos mutagênicos e antimutagênicos, tendo a vantagem de ser mais rápido que a análise de aberrações cromossômicas. Os micronúcleos, que podem ser um ou mais por células, resultam de fragmentos acêntricos ou cromossomos inteiros que se atrasaram em relaçao aos demais em sua migração para os pólos de célula na anáfase.

 

TRATAMENTO

 

Após 24 horas de estabilização em cultura:

 

- Descartar o meio de cultivo dos frascos de tratamento;

- Lavar as células duas vezes com 5ml PBS em temperatura ambiente, adicionando o PBS pelo teto do frasco. Remover o excesso de solução com pipeta Pasteur;

- Adicionar 5ml de meio de cultivo;

- Iniciar o tratamento conforme o protocolo;

- Terminado o tempo de cada tratamento , descartar o meio de cultivo e lavar as células duas vezes com 5ml de PBS temperatura ambiente;

- Adicionar 5ml de meio de cultivo novo;

- Adicionar a citocalasina B;

- Colher as células 18 horas após o início do tratamento.

 

3.1. Metilmetano sulfonato 4.10-2 M

 

O metilmetano sulfonato (MMS) é uma agente alquilante de ação direta, utilizado como agente indutor de danos no DNA, devido à sua capacidade de gerar sítios apurínicos, que podem resultar em quebras na fita do DNA durante o processo de reparo.

 

Metilmetano sulfonato 99,9% 20μl
PBS 6 ml

 

Modo de preparo:

Homogeneizar em frasco de vidro com tampa.

 

Observações: Preparar a solução na hora do uso. O metilmetano sulfonato 99% deve ser conservado no freezer.

Para o tratamento de uma hora utilizar 50ml de MMS 4.10-2 M para 5ml de meio de cultivo, obtendo-se uma concentração final de 0,4mM. A solução diluída não deve ser armazenada).

 

3.2. Citocalasina B solução mãe (2mg/ml)

 

A citocalasina é um inibidor da actina, age no final da divisão celular impedindo que a citocinese.

 

Modo de preparo:

Adicionar 2,5ml de DMSO ao frasco de 5mg de citocalasina B. Homogeneizar e armazenar em geladeira.

 

3.3. Citolocalasina B solução uso (300μg/ml)

 

Citocalasina B 2mg/ml  300 ml
PBS 1,7 ml

 

Modo de preparo:

Dissolver em frascos de congelamento, cobrir com papel alumínio, identificar e guardar em geladeira.

Aplicação: 50ml de citocalasina B solução uso para 5 ml de meio de cultivo, concentração final de 3μg/ml.

 

3.4. Solução Hipotônica de Citrato de Sódio

 

Citrato de Sódio Na3C6H5O7.2H2O (PM 294,10) 10 g
H2O deionizada q.s.p 1000 ml

 

Modo de preparo:

Agitar até completa diluição, guardar em frasco de 1000 ml, identificar e conservar na geladeira.

 

3.5. Fixador Metanol-Ácido Acético 3:1

 

Em proveta de 50 ml misturar:

Metanol  30ml
Ácido Acético glacial 10ml

 

* Caso sejam necessários outros volumes, a proporção 3:1 deve ser mantida.

Observação: O fixador deve ser preparado no momento do uso. O ácido acético glacial deve ser manuseado com cuidado em caso de acidentes lavar o local afetado com água corrente.

 

3.6. Tampão Sorensen

KH2PO4 (PM 136,09) fosfato monobásico de fosfato 5,26 g
Na2HPO4 (PM 141,96) fosfato dibásico de sódio anidro 8,65 g
H2O deionizada q.s.p. 1000 mL

 

Modo de preparo:

Em balão volumétrico dissolver os sais, completar o volume com água deionizada, agitar e corrigir o pH para 7,0.

 

3.7. Giemsa

 

Giemsa 3 g
Glicerina 162 mL

 

Modo de preparo:

Em frasco âmbar, misturar o giemsa com a glicerina e deixar em banho-maria 60ºC overnight. Posteriormente, adicionar 252ml de metanol e homogeneizar. Filtrar e guardar em frasco de vidro âmbar.

Obs.: Deixar envelhecer pelo menos 1 mês antes de filtrar

 

3.8. Corante Final Giemsa 5%

 

Tampão Sorensen 50 mL
Giemsa 2,5 mL

 

Modo de preparo:

Misturar o tampão com o Giemsa em vidro apropriado, e corar as lâminas por 5 minutos, cobrir as lâminas com cerca de 5ml de  corante.

 

Preparo de lâminas para colheita de micronúcleo

Lâminas novas devem ser lavadas com bucha e extran, ambos os lados. Enxaguar bem em água corrente e posteriormente em água destilada. Acondicionar em frascos de vidro, devidamente limpos, mergulhando a lâmina completamente em água destilada. Armazenar na geladeira.

Observação: realizar a limpeza e refrigeração das laminas um dia antes da colheita. Lâminas reutilizadas devem permanecer na solução sulfocrômica overnight e posteriormente devem ser bem enxaguadas e limpas.

 

COLHEITA DE MICRONÚCLEO PARA CÉLULAS V79

 

- Após o término da cultura, iniciar a colheita:

- Reservar o meio de cultura em tudo de centrífuga;

- Lavar o frasco de cultura 2 vezes com 5 ml de PBS em temperatura ambiente;

- Remover o excesso de PBS;

- Adicionar 0,5ml de tripsina 0,025% para colheita;

- Soltar as células;

- Inativar a tripsina com  o meio  de cultura reservado;

- Adicionar 1 gota de formol;

- Homogeneizar e centrifugar (1250 rpm por 5 minutos);

- Desprezar o sobrenadante deixando 1,5 ml de meio de cultura;

- Adicionar 1,5ml de citrato de sódio em temperatura ambiente pela parede do tubo;

- Homogeneizar suavemente e centrifugar (1250 rpm por 5minutos);

- Desprezar o sobrenadante;

- Suspender o sedimento;

- Adicionar 5ml de fixador [metanol / ácido acético (3:1)], homogeneizando rapidamente;

- Centrifugar (1250 rpm por 5minutos);

- Retirar o fixador;

- Adicionar fixador até obter a diluição celular desejada;

- Depositar uma gota de células sobre um lâmina limpa gelada, contendo um filme de água;

- Deixar secar;

- Corar as lâminas com Giemsa;

- Acondicionar o restante do material em microtubo, devidamente identificado;

- Armazenar as lâminas em caixa de madeira na geladeira.

 

Coloração de Giemsa para Micronúcleo

Corar as lâminas sobre grades na pia, cobrindo-as com cerca de 5ml de Giemsa 5%, durante 5 minutos. Remover o corante em água corrente. Secar a lâmina e levar ao microscópio ou guardar em caixa de madeira na geladeira.

 

Análise

 

Analisar a lâmina ao microscópio óptico, aumento de 1000 vezes (imersão), contar 1000 células binucleadas por tratamento, contabilizando as células binucleadas portadoras micronúcleos.

Os micronúcleos deverão ser menores que 1/3 do tamanho do núcleo original da célula, deverão ter a coloração semelhante à do núcleo, e não deverão apresentar ligação com o núcleo principal.

 

                   

 

4. Ensaio do cometa em V79 in vitro

 

O teste do cometa tem sido muito utilizado nos  últimos anos, para a avaliação de atividade genotóxica, este teste avalia a formação de quebras em fitas simples de DNA, que são reveladas através de uma microeletroforese, em lâmina, das células que sofreram o tratamento. Desta forma quanto maior a lesão do material genético maior será o número de fragmentos que irão migrar em relação ao núcleo.

 

TRATAMENTO

 

Para o teste do cometa cultivar as células em tubos de cultura contendo 2,5ml de meio de cultura.

Após 25 horas de estabilização em cultura:

- Descartar o meio de cultivo dos frascos de tratamento;

- Lavar as células duas vezes com 2,5ml PBS em temperatura ambiente, adicionando-o pelo teto do frasco. Remover o excesso com pipeta Pasteur;

- Adicionar 2,5ml de meio de cultivo novo;

- Iniciar o tratamento conforme o protocolo;

- Terminado o tempo de cada tratamento (pré ou pós), descartar o meio de cultivo e lavar as células duas vezes com 2,5ml de PBS;

- Colher as células ao final dos tratamentos.

 

4.1. Metilmetano sulfonato 2.10-2 M

 

Metilmetano sulfonato (MMS) 99% 20ml
PBS 12 mL

 

Modo de preparo:

Homogeneizar em frasco de vidro com tampa.

 

Observações: Preparar a solução na hora do uso. O metilmetano sulfonato 99% deve ser conservado no freezer.

 

4.1.1. Solução de MMS 4mM

 

Metilmetano sulfonato (MMS) 2.20-2M 1 mL
PBS 4 mL

 

Modo de preparo:

Homogeneizar em frasco de vidro com tampa.

 

Teste do cometa em cultura: Para o tratamento das células em cultura utilizar 75ml de MMS 4mM para 2,5ml de meio de cultivo, obtendo-se uma concentração final de 120μM. A solução diluída não deve ser armazenada.

 

4.2. Agarose Comum

 

Agarose comum 3 g
PBS 200 mL

 

Modo de preparo:

Dissolver a agarose em béquer de 500ml, agitar no agitador magnético. Ferver no forno microondas e agitar. Aguardar o resfriamento e solidificação da agarose, cortar a agarose  e ferver novamente no forno microondas, agitar e aguardar a solidificação. Repetir novamente o processo.

Armazenar em vidro com tampa na geladeira, devidamente identificado.

 

4.3. Agarose LMP 0,5%

Agarose LMP 0,25 g
PBS 50 mL

 

Modo de preparo:

Dissolver a agarose no próprio vidro de armazenamento. Agitar no agitador magnético. Ferver no forno microondas. Agitar. Aguardar a solidificação e armazenar em geladeira.

 

4.4. Solução de Lise Estoque

 

NaCl 2,5M (PM 58,44) cloreto de sódio 146,1 g
EDTA-titriplex 100mM (PM 372,24) 37,2 g
Tris 10mM (PM 121,14) 1,2 g
H2O deionizada 890 mL

 

Modo de preparo:

Homogeneizar em béquer de 1000ml. Adicionar aproximadamente 8g de NaOH até obter pH 10,0. Posteriormente, adicionar 10g de laurilsarcosinato de sódio, homogeneizar e acondicionar em frasco devidamente identificado

 

Observação: A solução de lise é cáustica, em caso de acidentes lavar o local afetado abundantemente com água corrente.

 

4.5. Solução de Lise Final

Triton X-100 1 mL
Dimetilsulfóxido (DMSO) 10 mL
Solução de lise estoque 89 mL

Modo de preparo:

Em proveta de 100ml adicionar o triton com auxílio de micropipeta a ponteira cortada, para melhor a dispensação do triton. Completar com DMSO e solução de lise. Com auxílio de papel parafilme, agitar a solução. Levar a solução em cubas de vidro para a geladeira.

 

Observação: A solução de lise é cáustica em caso de acidentes lavar o local afetado abundantemente com água corrente.

 

4.6. EDTA 200mM

 

EDTA-titriplex (PM 372,24) 14,89 g
H2O deionizada 200 mL

 

Modo de preparo:

Dissolver e adicionar pastilhas de NaOH até obter pH 10,0.

 

Observação: A solução permanecerá turva, enquanto o pH não estiver alcalino. Devido ao pH está solução é corrosiva em caso de acidentes lavar o local afetado com água corrente.

 

4.7.  NaOH 10N

 

NaOH (PM 40,0) hidróxido de sódio 40 g
H2O deionizada 100 mL

 

Modo de preparo:

Dissolver o NaOH em balão volumétrico de 100ml. Agitar com o agitador magnético. Armazenar em vidraria devidamente identificada por no máximo 14 dias.

Observação: A dissolução do hidróxido de sódio  é uma reação exotérmica, cuidado com o aquecimento da vidraria. O NaOH é uma solução altamente cáustica em caso de acidente lavar abundantemente a área afetada com água corrente.

 

4.8. Tampão de Eletroforese

 

EDTA-titriplex 200mM (PM 372,24) 5 mL
NaOH 10N (PM 40,0) hidróxido de sódio 30 mL
H2O deionizada à 4ºC q.s.p. 1000 mL

 

Modo de preparo:

Em proveta de 1000ml  misturar os agentes com auxílio de papel parafilme. Medir o pH, o mesmo deverá estar acima de 13.

 

Observação: Esta solução deve ser preparada no momento do uso. O tampão de eletroforese é uma solução cáustica em caso de acidentes lavar abundantemente o local afetado com água corrente.

 

4.9. Solução de Neutralização Tris pH 7,5

 

Tris 0,4M (PM 121,14) 48,5 g
H2O deionizada 950 mL

 

Modo de preparo:

Em um béquer dissolver o Tris. Adicionar HCl concentrado até obtenção do pH 7,5.

 

Observação: O HCl concentrado é extremamente corrosivo em caso de acidentes lavar o local afetado abundantemente o local afetado com água corrente. O HCl concentrado também é volátil, portanto deve-se tomar cuidado para não inalar os vapores, trabalhar preferivelmente em capela.

4.10. Brometo de etídio 200μg/ml

 

Brometo de etídio Sigma (PM 394,3) 2 mg
H2O deionizada 10 mL

Modo de preparo:

Dissolver o brometo em frasco âmbar e agitar. Acondicionar em geladeira devidamente identificado.

Observação: O brometo de etídio é um agente intercalante, mutagênico e  carcinogênico, portanto deve ser manuseado com atenção, calçando luvas. Em caso de contaminação de bancadas e microscópios, limpar imediatamente o local com álcool 70º. Em caso de acidente lavar o local afetado com água corrente. Descartar o material contaminado em lixo apropriado.

 

4.11. Brometo de Etídio 0,002mg/ml

 

Brometo de etídio Sigma 200mg/ml 1 mL
H2O deionizada 99 mL

 

Modo de preparo:

Dissolver o brometo e acondicionar em vidro coberto com papel alumínio. Identificar devidamente.

Observação: O brometo de etídio é um agente intercalante, mutagênico e  carcinogênico, portanto deve ser manuseado com atenção, calçando luvas. Em caso de contaminação de bancadas e microscópios, limpar imediatamente o local com álcool 70º. Em caso de acidente lavar o local afetado com água corrente. Descartar o material contaminado em lixo apropriado.

PRÉ-GELATINIZAÇÃO DAS LÂMINAS

 

Derreter novamente a solução de agarose comum, levar para banho-maria 60ºC em frasco com altura suficiente para um lâmina. Mergulhar a lâmina na agarose e remover o excesso de agarose no lado de trás da lâmina com o auxílio de papel higiênico. Depositar a lâmina em um superfície reta para secagem. Aguardar a secagem overnight das lâminas antes de armazenar em geladeira.

 

PROCEDIMENTOS GERAIS ANTES DO INÍCIO DA COLHEITA DO COMETA

 

- Remover as lâminas pré-gelatinizadas da geladeira (ver pré-gelatinização das lâminas);

- Derreter a agarose LMP e levar para banho-maria 37ºC;

- Preparar a solução de lise final e colocar em caixas de vidro para lâminas, cobertas com papel alumínio, levar para a geladeira.

 

PROCEDIMENTO PARA COLHEITA E ELETROFORESE NO TESTE DO COMETA

 

- Descartar o meio de cultura com o tratamento;

- Lavar as células 2 vezes com 2,5ml  PBS em temperatura ambiente;

- Desprezar o excesso com pipeta Pasteur;

- Adicionar 200ml de tripsina 0,025%;

- Aguardar o desprendimento das células;

- Inativar com 2,5 ml de meio de cultivo novo;

- Centrifugar em 1250 rpm por 5 minutos;

- Desprezar o sobrenadante deixando cerca de 0,5ml de meio de cultura;

- Em microtubo colocar 20ml de suspensão de células com 120ml de agarose LMP;

- Homogeneizar 2 vezes;

- Depositar a lâmina pré-gelatinizada;

- Cobrir com lamínula limpa;

- Levar à geladeira por 20 minutos;

- Remover a lamínula;

- Encaminhar a lâmina para a solução de lise gelada;

- As lâminas deverão permanecer na lise por pelo menos 1 hora.

 

PROCEDIMENTOS PARA A ELETROFORESE

 

- Colocar 1000ml de água destilada na geladeira para a preparação do tampão;

- Preparar o tampão no momento do uso com a água destilada refrigerada à 4ºC;

- Medir o pH, que deverá ser maior que 13;

- Colocar gelo na bacia da cuba de eletroforese;

- Dispor a cuba com o pólo negativo voltado para a direita;

- Depositar as lâminas na cuba com o lado fosco voltado em direção ao pólo negativo;

- Cobrir as lâminas com o tampão;

- Ajustar o aparelho (Set:  25V e 300mA);

- Deixar as lâminas no escuro por 20 minutos para o processo de denaturação do DNA;

- Após os 20 minutos de denaturação teclar Run e verificar a voltagem. Caso a voltagem ou a amperagem esteja incorreta, ajustar conforme a tabela 2;

- Uma vez ajustada a voltagem e a corrente elétrica deixar 20 minutos de corrida eletroforética na ausência de luz;

- Terminada a corrida retirar as lâminas do tampão e encaminhar para neutralização;

- Em grade neutralizar as lâminas cobrindo-se com 5ml de tampão de neutralização por 5 minutos;

- Remover o tampão e cobrir novamente a lâmina com 5ml de tampão de neutralização por 5 minutos. Repetir este processo mais uma vez, totalizando 15 minutos de neutralização;

- Deixar as lâminas escorrendo por cerca de 15 minutos

- Mergulhar as lâminas em etanol absoluto para fixação por 10 minutos.

- Retirar as lâminas, aguardar a secagem e guardar em caixa de vidro na geladeira.

Em caso de: Procedimento
Voltagem >25V Amperagem <300mA Retirar tampão de eletroforese
Voltagem < 25V Amperagem >300mA Adicionar tampão de eletroforese

 

 

COLORAÇÃO

 

No momento da leitura, depositar 100ml de brometo de etídio 0,002mg/ml sobre a lâmina e cobrir com lamínula. Terminada a leitura descartar a lamínula, deixar a lâmina secar e guardar.

 

ANÁLISE

 

Ligar o microscópio de fluorescência cerca de 15 minutos antes do inicio da leitura para estabilização do aparelho. Realiza-se a análise imediatamente após a coloração com BE, no aumento de 40X, em filtro de excitação 515-560nm de comprimento de onda e filtro de barreira 590nm.

O teste do Cometa permite observar a formação de uma cauda constituída de fragmentos de DNA, que foram  separados pela eletroforese. Em cada tratamento analisar 100 cometas classificando-os de 0 a 3, conforme o comprimento e intensidade da cauda.

Critério de classificação: (a) tipo 0, ausência de cauda; (b) tipo 1, cauda com até o diâmetro da cabeça do cometa; (b) tipo 2, cauda de tamanho médio, com 2 vezes o diâmetro da cabeça; (c) tipo 3, cauda longa, com comprimento superior a 2 vezes o diâmetro da cabeça. Analisar apenas os cometas que apresentam núcleos de mesmo tamanho, e desprezar os núcleos apoptóticos.

Após a leitura, realiza-se o score de cada tratamento multiplicando-se o número de núcleos observados em cada classe pelo valor da classe (0, 1, 2 ou 3). Obter o score total de cada tratamento.

 

 

5. Aberrações cromossômicas in vitro.

 

Muitos agentes mutagênicos físicos, químicos ou biológicos são capazes de induzir aberrações cromossômicas, desta forma há a necessidade de se incluir este teste in vitro, na avaliação de substâncias mutagênicas e antimutagênicas. O teste consiste em obter metáfases em boas condições de análise para identificar mudanças na estrutura cromossômica, tais como: quebras, gaps, deleções, anéis, cromossomos dicêntricos, figuras trirradiais, entre outras.

 

TRATAMENTO

 

Montar os frascos de tratamento e iniciar o tratamento após o término de um ciclo celular (12 hrs para CHO-K1 e 10hrs para V79), é importante salientar que para tratamentos em fases específicas do ciclo celular, o tempo de início do tratamento pode sofrer alterações.

 

Em caso de tratamento contínuo, adicionar colcemide de 1 a 2 horas antes da colheita.

 

Para tratamentos com tempo limitado, após o término do tempo descartar o meio de cultivo e lavar as células 2 vezes com 5ml de PBS em temperatura ambiente, repondo os 5ml de meio de cultivo. Adicionar colcemide de 1 a 2 horas antes da colheita.

 

5.1. Metilmetano sulfonato 5 mM

 

Metilmetano sulfonato 99,9 % 20μl
PBS 48 mL

 

Aplicar 100μl de MMS 5mM para 5000μl de meio de cultivo, obtendo uma concentração final de 100μM. A solução diluída deve ser preparada na hora do uso.

 

 

5.2. Mitomicina C

 

A mitomicina C (MMC) é um agente alquilante bifuncional de ação direta, capaz de gerar aductos no DNA, assim como ligações cruzadas intercadeia.

 

Preparo:

Dissolver 0,0012g de MMC (Sigma) em 4 ml de água destilada, obtendo-se uma solução mãe de. Filtrar em membrana de 0,22m. Para obtenção da solução uso (30mg/ml) dissolver 1ml da solução mãe em 9ml de água destilada estéril. Estocar no freezer e descongelar no momento do uso. Para 5ml de meio de cultura adicionar 50ml, obtendo uma concentração final de 0,3mg/ml.

 

5.3. Colcemide Solução Estoque (50μg/ml)

 

O colcemide um inibidor de polimerização de fuso mitótico, desta forma bloqueia a célula na metáfase, permitindo a análise das mesmas para a avaliação das aberrações cromossômicas.

Colcemide (Demecolcine Sigma cat.: D-6165) 1 mg
PBS 20 mL

 

5.4. Colcemide Solução de Uso (5μg/ml)

 

 Colcemide 50μg/ml 1 mL
PBS 9 mL

Aplicar:

100ml de colcemide 5μg/ml para os 5ml de meio de cultivo 1 hora antes da colheita ou;

50ml de colcemide 5μg/ml para os 5ml de meio de cultivo 2 horas antes da colheita.

COLETA DE CÉLULAS

 

Após o término do tratamento, iniciar o processo de coleta:

- Transferir o meio de cultivo para um tubo de centrífuga e lavar as células com 5ml de PBS temperatura ambiente, livre de Ca++ e Mg++ reservando o PBS com o meio de cultivo;

- Repetir o processo de lavagem com PBS, desprezando o PBS e retira a sobra de solução com pipeta Pasteur;

- Adicionar 0,5ml de uma solução de tripsina-EDTA a 0,025% até o desprendimento das células. Em seguida inativar a tripsina com o meio de cultura anteriormente reservado;

- Retornar a suspensão celular para o tubo de centrífuga e homogeneizar;

- Centrifugar por 5 min a 1250 rpm e remover o sobrenadante;

- Adicionar vagarosamente ao tubo 10ml de solução hipotônica (citrato de sódio 1%), na temperatura de  37oC, e homogeneizar com pipeta Pasteur (50 vezes), repetir o processo de homogeneização a cada 5 minutos até completar um período total de 20 minutos a partir da adição do citrato;

- Centrifugar por 5 min a 1250rpm e descartar o sobrenadante;

- Homogeneizar o sedimento com batidas leves e adicionar 5ml de fixador [metanol 3: ácido acético 1]. Homogeneizar imediatamente. Deixar na fixação por no mínimo 30 minutos;

- Centrifugar por 5 min a 1250 rpm;

- Descartar o sobrenadante e adicionar fixador até obtenção da diluição celular desejada;

- Preparar lâminas prova (usar lâminas limpas e conservadas em água gelada), depositar uma gota de suspensão celular em uma lâmina, inclinando-a levemente, e deixar secar;

 

- Reservar o restante de material em microtubo no freezer.

 

COLORAÇÃO E ANÁLISE DAS LâMINAS

 

Corar as lâminas com Giemsa a 5% em tampão Sorensen durante 5 min, lavar água corrente, secar ao ar e acondicionar na geladeira até a análise. A análise deve ser feita ao microscópio óptico no aumento de 1000x.

 

Para verificação de metáfases, avaliar imediatamente as lâminas observando a qualidade do material, antes de serem feitas as Lâminas definitivas.

A análise será feita observando-se 100 metáfases em cada cultura (50 em uma lâmina e 50 em outra). Serão observadas as alterações estruturais encontradas: “gaps” (cromátidicas e cromossômicas), quebras (cromatídicas e cromossômicas), anel, cromossomos dicêntricos, figuras tirradiais, quadrirradiais e rearranjos complexos.

 

6. Cultura de linfócitos para cariótipo humano

 

CULTURA:

 

- Colher de 5 a 10ml de sangue total heparinizado;

- Deixar o sangue em repouso por 2 horas para a separação de fases. Com pipeta Pasteur esterilizada suspender ligeiramente a camada de linfócitos com o plasma;

- Transferir o plasma contendo os linfócitos, para frascos de vidro com 7,5ml de meio RPMI 1640 (ver meios de cultivo), 2ml de soro bovino fetal e 0,2ml de fito-hemaglutinina;

- Cultivar durante 72hrs à 37ºC. Duas horas antes do término do cultivo adicionar 200μl de colcemide 50μg/ml (Ver aberrações cromossômicas).

 

COLHEITA:

 

- Transferir o meio de cultivo para um tubo de centrífuga;

- Centrifugar por 5 min a 1250 rpm e remover o sobrenadante;

- Repetir o processo de lavagem;

- Adicionar vagarosamente ao tubo 10ml de solução hipotônica de KCl 0,075M na temperatura 37oC, e homogeneizar com pipeta Pasteur, deixar por 10 minutos a partir da adição do KCl.

- Centrifugar por 5 min a 1250rpm e descartar o sobrenadante;

- Homogeneizar o sedimento com batidas leves e adicionar 5ml de fixador [metanol 3: ácido acético 1]. Homogeneizar imediatamente.

- Centrifugar por 5 min a 1250 rpm;

- Descartar o sobrenadante e adicionar fixador até obtenção da diluição celular desejada;

- Preparar 5 lâminas (usar lâminas limpas e conservadas em água gelada), depositar uma gota de suspensão celular em uma lâmina, inclinando-a levemente, e deixar secar;

- Corar uma lâmina com coloração de Giemsa normal e as restantes com coloração de Banda G;

- Reservar o restante de material em microtubo no freezer.

 

6.1. KCl 0,075M

 

KCl (PM 74,55) 5,5913 g
H2O destilada q.s.p. 1000 mL

 

             Modo de preparo:

Em balão dissolver o KCl em água destilada, acondicionar em geladeira.

 

6.2. Fito-hemaglutinina (GibcoBRL cat.: 10576-015)

 

Dissolver com água destilada conforme instruções do frasco. Conservar em geladeira.

 

 

COLORAÇÃO DE BANDA G

6.3. Tripsina 0,05%

 

Tripsina (1:250) GibcoBRL cat.: 27250-042 50 mg
PBS 100 mL

 

             Modo de preparo:

Dissolver a tripsina com o PBS e corrigir o pH para 7,4. Utilizar na em temperatura ambiente por 1 a 4 horas.

 

PROCEDIMENTOS PARA A TÉCNICA DE BANDA G:

 

Mergulhar a lâmina em tripsina 0,05% por um período entre 10 segundos a 1 minuto (variável). Remover a lâmina e mergulhar imediatamente em PBS gelado. Corar com Giemsa 5% por 5 minutos.

Cariótipo humano de um homem normal

 

Padrão normal de banda G em humanos

 

7. RT-PCR em tempo real (RT-qPCR)

 

7.1. Desenho de primers

 

Utilizar o programa Gene Runner para confeccionar os primers, atentando para os seguintes aspectos:

- Comprimento do primer: 18 a 24 bases

- Temperatura de desnaturação (TM = 54 a 72ºC)

Na prática: fórmula de Wallace: TM = 2(A + T) + (C + G)

Temperatura de anelamento (Ta) = TM – 5ºC

 

- Deve-se evitar a formação de estruturas secundárias (hairpin, dímeros, etc.)

- Se houver a formação de estruturas secundárias verificar dG (energia livre), que deve ser próxima de zero, e preferencialmente negativa.

- Quantidade de C + G = 50 a 60%

- Final 3’: os primers devem preferencialmente terminar com C ou G, para serem mais eficientes (3 pontes de hidrogênio), porém mais de 3 repetições GC devem ser evitadas (o primeer pode formar um “rabinho” e ter inespicificidade).

- O gene alvo deve ter sempre TM igual ou próximo ao do gene constitutivo.

 

7.2. Diluição de primers

 

Os primers vêm liofinizados. Ver escala que veio (25nmoles é a menor).

Diluir em água DEPC, com o máximo cuidado e no fluxo para evitar contaminação. Para isso adiciona-se o mesmo valor de água DEPC (em µl) que o valor em nmoles que veio. Essa concentração mãe de 1000 pmoles/µl. daí fazer uma diluição 1/10 para outra solução mãe, agora de 100 pmoles/µl. e dessa fazer outra diluição 1/10 para obtenção da solução de uso de 10 pmoles/µl.

 

Correlações:

1 µM = 1 µmol/l

1 µM = 1 nmol/ml

1 µM = 1pmol/µl

 

7.3. Extração de RNA (Recomendações do fabricante)

 

- Tripsinizar as células, centrifugar em tubos estéreis e descartar todo o sobrenadante;

- Adicionar 250 ul de água DEPC e 750 ul de trizol;

- Pipetar varias vezes e transferir para eppendorfs de 2 ml

- Homogeneizar no vórtex

- Incubar por 10 minutos a RT (se aparecer 2 fases antes da adição de clorofórmio, adicionar + trizol)

 Após a homogeneização e antes da adição do clorofórmio, as amostras podem ser estocadas a -70º C por no mínimo 1 mês.

- Adicionar 200 ul de clorofórmio e agitar vigorosamente por 15 segundos na mão e incubar por 5 min. a RT

- Centrifugar 4º/12.000 Xg/15 min. (o volume da fase aquosa é cerca de 70% do volume inicial de trizol);

- Transferir a fase aquosa para eppendorfs de 1,5 ml e adicionar 500 ul de isopropanol por 0,75 ml de trizol usado na fase inicial; homogeneizar;

- Incubar a temperatura RT por 10 minutos;

- Centrifugar 4º/12.000 Xg/10 min.

- Descartar o sobrenadante e lavar o pellet de RNA com 1 ml de etanol 75% (1 ml por 0,75 ml de trizol usado na fase inicial) no vórtex;

- Centrifugar 4º/7.500 Xg/5 min.

O RNA precipitado pode ser estocado em etanol 75% a 4ºC por pelo menos 1 semana e a -20ºC por pelo menos 1 ano.

- Seque brevemente o pellet de RNA e dissolva em 50 ul de água DEPC passando a solução várias vezes pela pipeta;

- Adicionar 5 ul tampão de DNAse (10% do volume);

- Incubar 15 minutos a 37ºC;

- Incubar 5 minutos a 65ºC;

- Transferir imediatamente para gelo.

 

TEB 10x

Tris

54g

EDTA

3,72g

 Ácido Bórico

27,5g

 

Observação: O pH deve estar em 8,3 (Não se deve acertar o pH em qualquer tipo de tampão).

 

7.4. Quantificação do RNA

 

Quantificar usando 100 µl de TE para o branco e 95 µl de TE + 5µl de RNA para a amostra.

Observar a quantidade de RNA, que deve ser suficiente para fazer o cDNA, e a razão entre as absorbâncias de 260 e 280 (A260/A280) que deve estar entre 1,9 e 2,1.

 

TE (Tampão Tris EDTA)

Tris HCl 1 M (pH 8,0) 1 mL
EDTA 0,5 M (pH 8,0) 200 µl
H2O MiliQ q.s.p. 100 mL

 

Observação: Tratar o frasco e os materiais com NaOH 1N e enxaguar com MiliQ. Autoclavar os materiais.

 

7.5. Verificação da integridade do RNA por gel de eletroforese

 

Fazer um gel de agarose a 1%. Por exemplo, 1g de agarose em 100 ml de TEB 1X. ferver no microondas, homogeneizar, aguardar esfriar um pouco e jogar na cuba. Deixar por proximadamente 1 hora para solidificar.

Misturar em eppendorfs 5µul de tampão da amostra, 2 µl de RNA e 1 µl de brometo de etídeo. Aplicar no gel e correr com tampão TEB 1X por 40 minutos a 80V.

Verificar a integridade do RNA no gel após a corrida eletroforética.

 

7.6. Síntese de cDNA

O RNA estando em quantidade suficiente, com boa pureza e íntegro, segue-se a síntese de cDNA em microtubo de o,2 ml:

 

dNTP 10 mM 2 µl
oligodT 10 pmol/µl 1 µl
RNA 500 ng/µl 2 µl
Água DEPC Completar o volume
Total 14,9 µl

 

 

- Incubar em termociclador a 65ºC por 5 minutos (Programa cDNA 1)

- Transferir para o gelo imediatamente (choque térmico)

- Adicionar no mesmo tubo:

 

Tampão da Mlv 5X 4 µl
RNAse out 0,1 µl
M-MLV-RT 1 µl
Total 20  µl

 

- Incubar no termociclador a 37ºC por 50 minutos e a 70ºC por 15 minutos (programa cDNA 2).

- Guardar o cDNA no freezer -80ºC.

 

7.7. PCR para testar o cDNA e os primers

 

- Em microtubo de 0,2 ml preparar:

Água DEPC 17,3 µl (sempre completar o volume para 25 µl)
Tampão da Taq 2,5 µl (sempre 10% do volume da reação)
MgCl2 50 mM 1 µl

 

dNTP 10 mM 1 µl
primer F 1 µl
primer R 1 µl
Taq comercial 0,2 µl
cDNA 1 µl
Total 25  µl

 

- Levar ao termociclador respeitando a temperatura de anelamento do primer (ver programa no termociclador).

- Guardar o produto de PCR em freezer -20ºC.

- Para a corrida eletroforética, preparar o gel de agarose conforme descrito anteriormente. Utilizar 3 µl de tampão da amostra e 5 µl de DNA. Correr a 80V por 2h30min a 3h.

 

7.8. RT-PCR em tempo real

 

Montar o mix:

Água DEPC 9,5 µl
primer F 0,5 µl
primer R 0,5 µl
Sybr 12,5 µl
Total 23  µl em cada tubo + 2 µl de cDNA

 

Exemplo: para curva de diluição (1/5, 1/10 e 1/20):

Água DEPC = 9,5 µl x 4 = 38 µl

primer F = 0,5 µl x 4 = 2 µl

primer R = 0,5 µl x 4 = 2 µl

Sybr = 12,5 µl x 4 = 50 µl

 

A. Procedimentos de rotina

 

1. Procedimentos para o uso do Medidor de pH

 

- Ligar o transformador do aparelho na energia (110V);

- Ligar o aparelho (B) e aguardar 15 minutos para estabilização térmica, deixando o aparelho em Stand by (Sb);

- Remover o reservatório de KCl 3M (1) e limpar ambos os eletrodos com água destilada, secar com papel higiênico sem friccionar;

- Abrir o respirador (2)

- Verificar se há presença de bolhas de ar no interior do eletrodo. Caso positivo agitar em posição vertical;

- Verificar o nível de KCl 3M no interior do eletrodo (deverá estar a cerca de 1 cm abaixo o orifício respirador (2) ), completar o volume caso necessário;

- Mergulhar ambos os eletrodos na solução a ser avaliada;

- Pressione a tecla de seleção (A) até a opção pH;

- Realizar a leitura e corrigir o pH caso necessário;

- Pressione a tecla de seleção (A) até a opção Stand by (Sb);

- Remover os eletrodos da solução e limpa-los com água destilada, secando com papel higiênico;

- Cobrir o eletrodo de vidro com o reservatório de KCl 3M (1);

- Fechar o respirador (2);

- Desligar o aparelho.

 

2. Procedimentos para o uso da Balança Analítica

 

- Ligar o aparelho na energia 110/220V;

 

- Aguardar aproximadamente 30 min para que a balança atinja temperatura ideal de funcionamento;

 

- Acionar a tecla liga/desliga em seu painél frontal;

 

- Remover qualquer resíduo de reagentes que possam estar presentes no prato da balança;

 

- Colocar o recipiente de pesagem sobre o prato da balança;

 

- Pressionar Tare para zerar a balança;

 

- Adicionar o material a ser pesado, até obtenção do peso desejado;

 

- Remover o material da balança;

 

- Repetir o procedimento para outros materiais a serem pesados;

 

- Pressionar liga/desliga;

 

- Desligar o aparelho, somente no final do expediente;

 

AO TÉRMINO DO USO, LIMPAR E DESLIGAR A BALANÇA ANALÍTICA.